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黄曲霉毒素检测方法的研究进展.doc

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黄曲霉毒素检测方法的研究进展贵州农业科学2006,34(5):123~126GuizhouAgriculturalSciences[文章编号31001—3601(2006)05—0294—0123—04黄曲霉毒素检测方法的研究进展赵飞,焦彦朝,连宾,刘晶(1.贵州大学化学工程学院,贵阳550003;2.贵州出入境检验检疫局,贵阳550004)[摘要]黄曲霉毒素是一类强致癌物质,许多国家已将其限量标准提高,并已成为国际贸易中新的技术壁垒.概述了黄曲霉毒素的性质,种类,来源及其限量标准,介绍了食品中黄曲霉毒素Bl检测方法的研究进展,并对其特点进行概括分析.另外。

还介绍了近年来国内外牛奶中黄曲霉毒素M?的检测方法.[关键词]黄曲霉毒素B?;黄曲霉毒素M?;限量标准;检测方法[中图分类号]TS20].6[文献标识码]AResearchProgressinDeterminationMethodsofAflatoxinsZHAOFei,JIAOYan—chao.,LIANBin,LIUJing(1.ChemicalTechnologyInstitute,GuizhouUniversity,Guiyang,550003;2.GuizhouEntryandExitInspeceionQuarantineBureau.Guiyang550004。

China)Abstract:AflatoxinjSahardcancengenicsubstance,jtslimitatablejndexwasraisedjnmanycountries,andhavebecomenewtechnicalbarriersininternationaltrade.Inthispaper,character,sourceandlimitatablestandardofaflatoxinwasintroduced.ResearchprogressindeterminationmethodsofAFB1infoodweredescribed,theircharacteristicsweresummarilyanalyzed。

Inaddition,ThedevelopmentathomeandabroadaboutthemethodofdetectingAFMlinmilkinrecentyearswasalsointroduced.Keywords:aflatoxinBl;aflatoxinMl;limitatablestandard;determinationmethod1黄曲霉毒素的来源及理化性质黄曲霉毒素(Aflatoxin.AFT)是20世纪60年代初发现的一种真菌有毒代谢产物,它是由曲霉属中的黄曲霉和寄生曲霉产生l1],能够导致肝脏坏死癌变,肺癌,结肠癌,胃癌,肾肿瘤等[2],引起急性和亚急性中毒。

黄曲霉毒素的基本结构为二呋喃环和香豆素,其毒性是氰化钾的10倍,砒霜的68倍,在食品和饲料中含1mg/kg以上就有剧毒.因此,受到了世界各国的普遍关注.黄曲霉毒素依据其化学结构的不同和产生的衍生物有20余种,黄曲霉毒素B.,B,G.,G,M.,M等17种相关化合物的结构已经过系统鉴定.其中最主要有B,B,G.,G,M等5种.在紫外线下,黄曲霉毒素B.,B发蓝色荧光,G.,G发绿色荧光.黄曲霉毒素的分子量为312~346.难溶于水,易溶于油,甲醇,丙酮和氯仿等有机溶剂,但不溶于石油醚,己烷和乙醚中.一般在中性及酸性溶液中较稳定,但在强酸性溶液中稍有分解,在pH9~10的强碱溶液中分解迅速。

其纯品为无色结晶,耐高温,黄曲霉毒素B.的分解温度为268℃,紫外线对低浓度黄曲霉毒素有一定的破坏性.黄曲霉毒素M.(AFM.)是黄曲霉毒素B(AFB.)的羟基化代谢产物,属于二氢呋喃杂萘邻酮衍生物.其主要存在于牛奶中,该毒素由Alleroh(1963)首先在牛奶中发现,并命名(1965)为黄曲霉毒素M(AflatoxinM),区分为Ml和M2,20世纪60年代后期研究发现M.有致癌性[3].其外观为白色或微黄色的粉末,分子式为C.H.O,分子量为328.3g/moL.经毒理学研究,AFMl的LD5.一[收稿日期]2005—12—19;2006—07—19修回[基金项目]贵州出入境检验检疫局科技项目(o4JKO5)[作者简介]赵飞(1978一)。

男,在读硕士,研究方向:食品安全与质量控制.*通讯作者:焦彦朝,研究员,从事动植物食品检验检疫.E—mial:yqiao88@yahoo.com.ca[12][133[143[15][16]肖厚荣,张悠金,朱仁发,等,从烟梗中提取果胶工艺研究[J],烟草科技,2002(3):36—38.MoloneyMM,Molecularfarminginplants:achievementandprospects~J].BiotechnologyEngineering,1995(9):39.黎定军,周清明,罗宽.烟草分子农业的研究进展与应用前景[J],湖南农业大学(自然科学版)。

2003,29(2):171—174.韩锦峰,刘华山,张秀荣,等.分子农业——一个大有发展前送的农业领域[J],河南农业科学.2004(1):610,王关林,方宏筠.植物基因工程原理与技术(第二版)[M].北[17][18][193京:科学出版社.2002,106—120.付钰,曾君祉,黄浩民.抗膀胱癌单链抗体基因在烟草中的表达[J].自然科学进展,1999,9(6):528—530.李缨,张清波,邬祥惠.乙型肝炎表面抗原基因在烟草中的表达[J].中华传染病杂志,2001,19(5):266—269.李霞.陈杭,李晓东,等.疟疾多抗原表位基因表达载体的构建及其在烟草中的表达[J]。

生物工程进展,1999,19(4):39—44,(责任编辑:高红卫)厂/?124?贵州农业科学0.3mg/kg(oral,duckling),WHO(1987)将其定为一类致癌物,是被公认的肝致癌物和DNA破坏剂].研究表明,牛奶中的AFM主要由于牛食用了被AFB污染的饲料后,在肝微粒体单氧化酶系催化下,AFB末端呋喃环C一1O羟基化产生的影响.2黄曲霉毒素的限量标准由于黄曲霉毒素的危害及分布的广泛性,世界各国非常重视食品和饲料中黄曲霉毒素的含量问题,并AFM.每年全世界约有259/5的谷物受到霉菌毒素确定了食品中黄曲霉毒素的最高允许含量(表1)。

表1世界各国及地区对食品中黄曲霉毒素的最高允许含量[.]根据各国对食品中黄曲霉毒素最高允许含量的不同,加之近年来限量标准有明显的提高,同时为了促进进出口贸易的发展,各国对黄曲霉毒素的检测方法有了更高的要求.3检测方法3.1黄曲霉毒素B.的检测方法与比较3.1.1检测方法目前食品中AFB限量已经成为限制出口的技术壁垒,为保障食用者的健康及出口贸易需要,提高AFB的检测能力,发展快速准确灵敏的检测技术势在必行.自2O世纪6O年代以来,建立的检测方法已经达3O余种,这些方法可分为五大类:一类是定性检测方法,主要是一些简单生物学方法(约1O种,现在已停止使用)。

第二类是半定量检测方法,如薄层色谱法(TLC);第三类是定量检测方法,包括建立在色谱基础上的理化方法,如液相色谱法(LC),高效液相色谱法(HPLC)和近年来新发展起来的质谱检测(MASS);第四类是建立在免疫化学基础上的快速测定的方法,如放射免疫测定(RIA)和酶联免疫测定方法(ELISA);第五类是免疫化学和仪器分析结合的方法,免疫亲和柱一荧光分光光度法,免疫亲和柱一HPIC法等.这里主要介绍TLC,HPLC和LISA三类.(1)薄层色谱法(TLC).TLC法是检测AFB的最常用的方法,也是我国测定食品及饲料中AFB的国家标准方法之一.其原理是试样中黄曲霉毒素B经提取。

浓缩,薄层分离后,在波长365nm紫外光下产生蓝紫色荧光,根据其在薄层上显示荧光的最低检出量来测定含量.TLC有单向展开和双向展开法,其中双向展开法能进一步除去样品中的杂质,提高灵敏度.虽然TLC法由于设备简单,成本低,易于普及到基层单位测定,国内外仍然使用,但由于该方法操作步骤多,样品前处理烦琐,并且提取和净化效果不够理想,提取液中杂质较多,因而在展开时影响斑点的荧光度,导致灵敏度下降.但TLC法是检测AFB的经典方法,仍为普通实验室的常用方法.目前,在TLC法基础上又发展了高效薄层层析法(HPTLC),该法可同时测定4种黄曲霉毒素B,B,G,

G,具有样品前处理过程简单,净化效果好,检测速度快,效率好的特点.张鹏,赵卫东,张艺兵等采用以多功能净化柱(MFC)净化结合高效薄层色谱法测定食品中黄曲霉毒素,以空白样品为基底进行0.5ug/kg,2.0ug/kg,10ug/kg3水平回收率实验,平均回收率达到86.5~99.0㈨.(2)高效液相色谱分析法(HPLC).HPLC是近几年发展起来的检测AFB的方法,主要是用荧光检测器检测,在适宜的流动相条件下,采用反相C柱,使多种黄曲霉毒素同时分离.原理:样品中的黄曲霉毒素B经柱层分离后,通过测量色谱峰的面积计算含量.该方法的优点是特异性强,灵敏度高。

定量准确,可同时分离多种黄曲霉毒素,操作简便,定量精确,适于大批量样品的分析.但所需色谱仪,积分仪价格昂贵,而且前处理复杂,建立方法比较困难,操作时需要专门的技术人员,目前未能广泛使用.涂文升应用该方法同时检测食品中4种黄曲霉毒素,分离效果好,重复性强,最低检出限达到pg级水平.回收率在92.61~99.25[1.(3)酶联免疫法(ELISA).ELISA方法是利用免疫,酶及生化技术来检测AFB,开辟了AFB分析的新领域.ELISA是2O世纪7O年代出现的新的免疫技术,最初由荷兰学者VANWEEMAN和瑞典学者ENGVALL与PERLMAN同时提出1,主要用于病毒的检测,7O年代中后期开始用于真菌毒素的检测。

其原理是:样品中的黄曲霉毒素B.与定量特异性抗体反应,多余的游离抗体与酶标板内的包被抗原结合,加入酶标记物和底物后显色,与标准比较来测定含量.该方法灵敏度高,特异性强,第5期赵飞等黄曲霉毒素检测方法的研究进展检测结果稳定准确,实验操作污染少,一次实验可检测多个样品.我国应用酶联免疫方法测定食品中黄曲霉毒素的方法原理是:试样中的AFB经提取,脱脂,浓缩后与定量特异性抗体反应,多余的游离抗体则与酶标板内的包被抗原结合,加入酶标记物和底物后显色,与标准比较测定含量n.目前AOAC在检测食品中黄曲霉毒素时,常用该方法对玉米,棉籽,花生和花生酱中黄曲霉毒素B。

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