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肉及肉制品中猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅、兔源性成分的快速鉴定 实时PCR法 编制说明.doc

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肉及肉制品中猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅、兔源性成分的快速鉴定实时PCR法编制说明一、任务来源本标准由中华人民共和国商务部提出并归口,由商务部流通产业促进中心实验室生物检测室研究小组完成方法的建立优化、标准的起草制定工作。二、编制依据本标准遵循GB/T1.12009《标准化工作导则第1部分:标准的结构和编写》、GB/T20001.42001《标准编写规则第4部分:化学分析方法》的编写规则、GB/T6379《测量方法与结果的准确度(正确度与精密度》第2部分:确定标准测量方法重复性与再现性的方法》。三、目的和意义随着市场经济的不断深入发展,部分不法商贩为了谋求不正当利益,

在肉(制)品中掺杂其他价格便宜的肉种,在肉(制)品市场出现了一种“以次充好、以假乱真”的现象。通过实验室前期大量的调查研究分析,我们发现肉(制)品中掺杂、掺假的现象已经十分普遍,大部分肉(制)品中掺有标称以外的其他价格便宜的动物源性成分,有的甚至全部为标称以外的其他价格便宜的动物源性成分。这极大地损害了消费者的利益,扰乱了流通市场秩序和健康发展,同时也对民族宗教信仰造成一定的潜在冲突。但目前,相应的检测鉴定方法标准的缺失,使得检测监测机构对此无标可依,无法可循,难于判断和裁决。为了规范国内市场流通秩序,保证市场的正当竞争,保护消费者的经济利益和对所购买商品的选择权、知情权及宗教信仰归属,制定本检测标准。

四、编制过程《肉及肉制品中猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅、兔源性成分的快速鉴定实时PCR法》该方法标准由商务部流通产业促进中心起草编写。经过中国科学院微生物研究所、中国农业科学院饲料研究所、中国农业大学食品科学与营养工程学院三家单位进行了方法的复核验证实验,并提交了具体的复核验证报告。根据国家有关标准制定和修订工作的要求,商务部流通产业促进中心在《肉及肉制品中猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅、兔源性成分的快速鉴定实时PCR法》的起草编制过程中,主要工作包括以下几个方面:1、详细查阅了国内、国外有关标准和相关专业期刊上发表过的参考文献等技术资料,如食品、化妆品和饲料中牛、羊、猪源性成分检测方法及动物源性饲料中哺乳动物源性成分定性检测方法等国内已申请的相关检验报告。

并对这些资料进行了详细的对比,从方法的先进性、可靠性和实用性等几个方面考虑,选取了几个代表性的参考资料作为标准起草中的主要技术参考文本。2、及时购置相关的实验试剂、标准品和其他材料;设计了实时荧光PCR方法检测动物源性成分的特异性引物和探针,并对其特异性进行了实验验证;摸索不同条件对引物对、探针及模板的浓度进行优化;对检测灵敏度和检测底限进行了确证;对混合肉样进行了鉴别试验。最终确定了最佳的检测方法,并确保本方法可以特异、灵敏、准确地对肉及肉制品中的动物源性成分进行快速、实时地鉴别。3、在技术指标完成试验工作之后,严格按照标准编写要求的体例格式,起草编写标准文本和编制说明。4、向相关行业的30多位专家、学者、教授、技术人员、从业人员、管理人员等进行了意见征求。

收到意见后尽快参考反馈意见,根据实际情况,吸收正确、可行的建议或意见,并在标准征求意见稿中进行进一步修改和完善。5、向中国科学院微生物研究所、中国农业科学院饲料研究所、中国农业大学食品科学与营养工程学院三家单位提供标准方法的文稿和编制说明,提出了验证复合的要求,进行了方法的验证。三家单位都具有相应的检测设备,具备专业的生物学检测技术与丰富的检测经验。经过复核单位的独立、科学和严格的复核验证后,提供了三份复核验证报告。五、标准验证工作总结根据国标委主管部门的要求,起草小组按照标准所涉及的实验内容,制备了相应的实验材料,并编写了《肉及肉制品中猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅、兔源性成分的快速鉴定实时PCR法(验证说明)》。

邀请了中国科学院微生物研究所、中国农业科学院饲料研究所、中国农业大学食品科学与营养工程学院等三家科研单位,对该标准的技术原理、方法路线、方法特异性及方法灵敏度等方面进行了客观地验证试验和评价。验证工作结束,起草小组将回收的大量验证数据和实验图片整理归纳,形成了《参加验证单位对标准方法的建议评价汇总表》和《验证试验结果汇总》,并本着科学认真的态度对相应的建议和意见进行处理,在标准中作相应修改。通过严谨认真的实验验证及对标准文字材料进行的审核,3家单位一致认为该标准技术路线科学合理、方法灵敏度高、特异性强,标准科学、简单、实用,易于推广,建议尽早申报发布实施。六、标准技术方面说明(一)方法概述及原理在新的形势下。

对肉(制)品中肉种的鉴别,传统感官方法对肉(制)品色泽、气味、组织性状等进行判断,显得可靠性、科学性不足。尤其对一些添加了色素、芳香剂的肉(制)品,及加工处理过的肉制品,感官判断更显得难度高和风险性大。本标准方法以分子生物学中荧光定量PCRTaqman探针法为基础,从基因水平对肉种DNA进行鉴别鉴定。荧光定量PCR技术是生命科学领域新出现的一种检测定量技术,这项新技术利用发光技术对PCR扩增过程进行实时检测,能达到准确对样品中DNA的初始量进行定量,整个过程闭管操作。扩增反应结束,可以直接获得检测结果,不需要传统PCR方法后继的电泳染色等繁琐步骤,减少了检测判定时间,更为重要的是在很大程度上减小了后继电泳加样带来污染假判和EB等核酸染料对操作人员造成的“三致”危害。

线粒体存在于动物体绝大多数类型细胞中,是动物细胞中含量很高的一个细胞器。线粒体细胞色素氧化酶b(Cytb),是线粒体基因组中一个功能性生物酶,目前在Genbank上已有大量编码该酶的DNA序列注册。以提取的肉(制)品中动物组织DNA为PCR扩增模板,以分别针对猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅、兔的特异性扩增探针引物进行实时荧光定量PCR扩增反应,最终对样品中目标DNA进行判定,达到对样品中所含成分进行鉴别判断。通过对方法的条件优化、特异性、检测限等参数进行优化确定后,建立适用于实验室的检测方法,使检测工作更加规范、可靠、可信,解决实际的工作问题。(二)主要实验技术论证1.实验技术路线实验中所用到的技术方法及主要实验技术路线如下图示:从Genbank获取猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅及兔Cytb基因序列。

运用生物软件进行分析,设计合成特异性PCR扩增引物及探针对所设计合成的引物对进行特异性验证,选择检测鉴定最佳引物对对最佳引物对及探针的最佳工作浓度进行试验优化以最佳工作浓度引物对及探针,对检测模板DNA的量进行试验优化试验确定检测方法的检测极限、灵敏度制备不同形式的添加样本,进行方法验证试验确定PCR扩增反应的最佳工作参数,初步建立检测鉴定方法建立对猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅及兔源性检测的快速鉴别实时PCR检测方法2.实验内容一猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅及兔Cytb基因序列获取及分析比较以Genbank上已经登录公布的所有猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅及兔Cytb基因序列为基础。

运用生物软件DNAMAN进行序列比对分析,找出来自不同国家、地区、品种猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅及兔Cytb基因种内保守序列区域,用于设计上下游扩增引物及探针。将所设计出的各物种PCR扩增引物及探针进行再次比对,排除种间交叉性,保证扩增的特异性。最后,将获得的各物种上下游扩增引物及探针序列提交Genbank,进行Blast确认,以确保所设计的引物及探针序列对目前已经公布的DNA序列没有非特异性检测扩增。最终确定的引物及探针序列如表1所示,将其送至生物服务公司进行合成。表1引物序列、扩增位点及长度和扩增条件畜禽种类引物、探针序列Tm值℃扩增位置、预期大小猪PorcineFP:CGACAAAGCAACCCTCACAC59509579bp71bpRP:TGCGAGGGCGGTAATGAT58Probe:FAMCTTCGCCTTCCACTTTATCCTGCCATTCTAMRA68牛BovineFP:CTCCTCGGAGACCCAGATAAC59744822bp79bpRP:AGAAGTATCACTCGGGTTTG59Probe:FAMCCAGCCAATCCACTCAACACACCCTAMRA70羊SheepFP:CAGCCCTCGCCATAGTTCAC59569666bp98bpRP:AGGGTGGAAGGGAATTTTATCTG58Probe:TCTTCCTCCACGAAACAGGATCCAACA68马HorseFP:CCAATGCGTATTCTGACTCTTAGTG59962105bp81bpRP:CGATAATTACGTATGGGTGTTCC58Probe:FAMCTGACACTAACATGAATCGGCGGACAGCTAMRA68驴DonkeyFP:CCTCAGCACTCCCCCTCAT60782869bp77bpRP:AAGGATAAGGGCTAATACACCA59Probe:FAMCCAGAATGGTATTTCCTATTTGCTTACGCCTAMRA69鸡chickenFP:CGACAACCCAACCCTTACC59512601bp89bpRP:AGGAAGGTGAGGTGGATGATA59Probe:FAMACACTTCCTCCTCCCCTTTGCAATCGCTAMRA69鸭DuckFP:GGCCACACAAATCCTCACAG59125209bp85bpRP:TGTGTTGGCTACTGAGGAGAAA59Probe:FAMCCTACTGGCTATGCACTACACCGCAGACTAMRA69鹅GooseFP:AGACAATCCAACCTTAACCCGA59512588bp77bpRP:GGACTAGGGTGATTCCTGCA58Probe:FAMCCATCCACTTCCTACTGCCCTTCCTATAMRA68兔RabbitFP:GTTCTCGTCGCAGATCTTCTCA589781058bp73bpRP:TACTTGTCCAATGGTGATGAAC58Probe:FAMCACTCACATGAATCGGAGGCCAACCAGTATAMRA683.动物基因组DNA提取3。

1动物肌肉组织DNA小量提取(以商业试剂盒进行提取)a.将称取的肉糜,放入研钵中,加入液氮,待样品冷冻完全后快速、用力研磨至粉末状。研磨时应间断加入液氮以防止材料融化;b.将研钵移入65℃水浴,当样品粉末刚开始融化时,向研钵中加入700μL的SolutionA和1.2μL的RnaseA,研磨30s;c.收集650μL研磨好的组织匀浆至CollectionTube中。如匀浆体积不足650μL,请补充SolutionA至650μL。65℃保温10min;d.加入400μL的SolutionB,振荡混匀;e.加入1mL的4℃预冷的SolutionC,充分混匀后,12000rpm离心2分钟。

f.弃去上层有机相,再加入1mL的4℃预冷的SolutionC,充分混匀后,12000rpm离心2min;g.弃去上层有机相,然后将水相溶液(无色下层)转移至置于CollectionTube上的FilterCup中,12000rpm离心1min;h.弃FilterCup,在滤液中加入400μL的DBBuffer,混合均匀;i.将试剂盒中的SpinColumn安置于CollectionTube上。将上述操作的混合溶液转移至SpinColumn中,12000rpm离心1min,弃滤液;j.将500μL的RinseA加入至SpinColumn中,12000rpm离心30s,弃滤液;k。

将700μL的RinseB加入至SpinColumn中,12000rpm离心30s,弃滤液;l.重复上步操作;m.将SpinColumn安置于新的1.5mL的离心管上,在SpinColumn膜的中央处加入50-200μL的灭菌蒸馏水或ElutionBuffer,室温静置1min;n.12000rpm离心1min洗脱收集DNA。3.2动物肌肉组织DNA大量提取-CTABNacl法(参照文献进行)a.取2g硏碎的样本肌肉组织,至50mL离心管中,加10mLCTABNacl裂解液,65℃振荡水浴1h;b.加入10μLProteinaseK(20mg/mL),65℃振荡水浴,过夜。

c.取1mL过夜处理液至Eppendorf离心管中,12000rpm离心10min;d.取800μL离心上清至新离心管中,加入600μL氯仿,充分混匀,12000rpm离心10min;e.取600μL上层水相至新的离心管中,加入500μL预冷异丙醇,上下颠倒离心管,室温沉淀DNA30min;f.12000rpm离心10min,弃异丙醇,加入1mL75%冰乙醇进行洗涤DNA,12000rpm离心2min,弃尽乙醇,室温下风干,加入适量ddH2O溶解DNA,并测定OD260值。提取DNA的A260在1.0500ng/μL,A260/A280在1.82.0之间为佳。4.实验内容二检测方法的建立提取各物种基因组DNA作为模板。

以合成好的引物对进行检测方法的建立,分别对最佳引物、探针工作浓度及DNA模板量等参数进行优化。在实验中荧光定量PCR的反应体系及参数参考了酶试剂公司推荐的最佳体系及参数,具体如下:反应体系:MasterMix(2)10.0μL上游引物FP2.0μL下游引物RP2.0μL探针Probe(250nM)2.0μL模板DNATemplate(50ng)1.2μLddH2O2.8μL20μL反应体系反应参数:50℃2min→95℃10min→40(95℃15s→60℃1min)收集荧光4.1引物浓度优化为了使特定浓度扩增引物能产生最强的荧光信号、最佳的扩增曲线。

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