微生物实验指导网络版

2021-04-25 13:23:51本页面

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【正文】

《微生物学》实验指导书 《微生物学》 实验指导书 二零零六年十月 目录 实验一显微镜油浸系物镜的使用 3 实验二细菌形态的观察 4 实验三细菌简单染色法及口腔微生物的观察 5 实验四细菌的革兰氏染色 7 实验五细菌的芽胞染色 8 实验六酵母菌的形态观察实验 10 实验七霉菌的形态观察 12 实验八细菌大小的测定 14 实验九细菌数量的测定(血球板计数) 16 实验十培养基的配制 19 实验十一消毒与灭菌 21 实验十二稀释平板计数及微生物菌落形态的观察 27 实验十三紫外线对微生物生长的影响 30 实验十四抗生素对微生物的作用 30 实验十五比浊法测定大肠杆菌的生长曲线 31 实验十六土壤中好气性细菌的分离与计数(附划线分离法) 32 实验十七土壤中放线菌的分离与计数 35 实验十八土壤中真菌的分离与计数 36 实验十九纤维素分解试验 37 实验一显微镜油浸系物镜的使用 一、实验目的和实验内容 目的:复习显微镜低倍镜和高倍镜的使用技术。

了解油浸系物镜的基本原理,掌握油浸系物镜的使用方法 内容:1、学习油浸系物镜的使用方法 2、用油镜观察细菌三型和放线菌染色装片 二、实验材料和用具 细菌三型、放线菌的染色装片,香柏油、二甲苯,显微镜、擦镜纸。 三、操作步骤 (一)观察前的准备 1、将显微镜置于平稳的实验台上,镜座距离实验台边沿约4厘米。坐正,练习用左眼观察。 2、调节光源:将低倍镜转到工作位置,将光圈完全打开,聚光器升至与载物台相距约一微米左右。转动反光镜采集光源,光线较强的天然光源宜用平面镜,光线较弱的天然光源或人工光源宜用凹面镜,对光至视野内均匀明亮为止。观察染色装片时,光线宜强;观察未染色装片时,

光线不宜太强。 (二)低倍镜观察染色装片 首先上升镜筒,将细菌三型染色装片置于载物台上,用标本夹夹住,将观察位置移至物镜正下方,物镜降至距离装片0.5厘米处,适当缩小光圈然后两眼从目镜观察,转动粗调节器使物镜逐渐上升(或使镜台下降)至发现物象时,改用细调节器调节到物象清楚为止。移动装片,把合适的观察部位移至视野中心。 (三)高倍镜观察 眼睛离开目镜从侧面观察,旋转转换器,将高倍镜转至正下方,注意避免镜头与玻片相撞。再由目镜观察,仔细调节光圈,使光线的明亮度适宜。用细调节器校正焦距使物象清晰为止。将最适宜观察部位移至视野中心,绘图。不要移动装片位置,准备用油镜观察。 (四)油镜观察 1、提起镜筒约2厘米。

将油镜转至正下方。在玻片标本的镜检部位(镜头的正下方)滴一滴香柏油。 2、从侧面注视,小心慢慢降下镜筒,使油镜浸在油中至油圈不扩散为止,镜头几乎与玻片接触,但不可压及装片,以免压碎玻片,损坏镜头。 3、将光圈调亮,左眼从目镜观察,用粗调节器将镜筒徐徐上升(切忌反放向旋转),当视野中出现物象时,改用细调节器调节到物象清楚为止。如因镜头下降未到位或镜头上升太快未找到物象,必须再从侧面观察,将油镜降下,重复操作直至物象看清为止。仔细观察并绘图。 4、再次观察提起镜筒,换上放线菌染色装片,依次用低倍镜、高倍镜和油镜观察,绘图。重复观察时可比第一次少加香柏油。 (五)镜检完毕后的工作 1、提起镜筒。

或降下载物台 2、移开物镜镜头 3、取出装片 4、清洁油镜油镜使用完毕后,须用擦镜纸擦去镜头上的香柏油,再用擦镜纸沾少许二甲苯擦掉残留的香柏油,最后再用干净的擦镜纸擦干残留的二甲苯。 5、擦净显微镜,将各部分还原。将物镜呈“八”字形降下,不可使其正对聚光器,同时降下聚光器,转动反光镜使其镜面垂直于镜座。最后套上镜罩,对号放入镜箱中,置阴凉干燥处存放。 四、注意事项 1、使用油镜必须按先用低倍镜和高倍镜观察,再用油镜观察的程序操作。 2、下降镜头时,一定要从侧面注视,切忌用眼睛对着目镜,边观察边下降镜头的错误操作,以免压碎玻片而损坏镜头。 3、使用二甲苯擦镜头时,注意二甲苯不能过多。

以防溶解固定透镜的树脂。 4、注意保持显微镜的洁净,对金属部分要用软布擦拭,擦镜头必须用擦镜纸,切勿用手或用普通布、纸等,以免损坏镜头。 五、演示 如何使用油镜观察染色装片的要点,如滴油、下降镜头、调焦、擦拭镜头等 六、实验报告 分别绘出在高倍镜和油镜下观察到的枯草芽孢杆菌及金黄色葡萄球菌的形态,注明物镜放大倍数和总放大率 七、问题和思考 1、油镜与普通物镜在使用方法上有何不同?应特别注意些什么? 2、使用油镜时,为什么必须用镜头油? 3、镜检标本时,为什么先用低倍镜观察,而不是直接用高倍镜或油镜观察? 实验二细菌形态的观察 一、实验目的和实验内容 目的:巩固油镜的使用。

掌握细菌形态观察的基本方法,了解细菌的基本形态 内容:1、观察细菌的基本形态染色装片 2、观察枯草芽孢杆菌活菌 3、观察细菌细胞结构的染色装片 二、实验材料和用具 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌;变形菌装片 三、操作步骤 (一)、观察细菌的基本形态 用低倍镜、高倍镜和油镜观察大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、变形菌的染色装片,并分别在油镜下绘图 (二)、观察枯草杆菌活菌 常用压滴法: 1、将洁净无油腻的载片放于自己正前方,在中央放一滴无菌水 2、将酒精灯放于自己正前方,点燃 3、用无菌操作方法从枯草芽孢杆菌斜面中沾取少量菌体,与载片上的随地充分混匀,把接种环上残留的菌体杀灭后。

放回试管架 4、用镊子夹一洁净的盖玻片,使其一边先接触菌液,然后将整个盖玻片慢慢放下,注意不要产生气泡。如菌液过多,可用吸水纸吸去一部分。 5、先用低倍镜然后转用高倍镜观察,观察时光线要适当调暗一些。 四、注意事项 1、注意擦镜头时,只能用擦镜纸 2、观察完毕,必须将镜筒上升,才能取下装片,放入另一装片后,要按使用油镜要求,重新操作,不能在油镜下直接取下和替换装片 3、无菌操作过程中,接种环美军后不能触及其他物品,挑菌不能过多 五、演示 1、细菌细胞结构装片示范镜 2、无菌操作过程 3.怎样盖盖玻片才不产生气泡。 六、实验报告 (一)绘图 1.绘出你所观察到的几种细菌的个体形态视野图 2.绘出你所观察到的细菌细胞结构视野图。

并注明各部分 (二)试指出在制备活菌装片时,应注意什么问题? 七、问题与思考 1.用明视野显微镜观察细菌的形态时,你认为用染色装片好,还是用非染色的活体装片好,为什么?观察活体装片与染色装片,光线调节各有什么不同? 2.无菌操作过程中,可否将棉塞放在桌面上?为什么? 实验三细菌简单染色法及口腔微生物的观察 一、试验目的和实验内容 目的:巩固无菌操作技术,掌握细菌的涂片和单染色技术,了解口腔中的微生物及其观 察方法。 内容:1、细菌单染色操作技术 2、染色法或负染色法观察口腔中的微生物 二、实验材料和用具 大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的斜面菌种。

吕氏美蓝染色液、石炭酸复红染色液、黑色素液或碳素墨水、香柏油、二甲苯、无菌水、显微镜、擦镜纸、接种环、酒精灯、载玻片、吸水纸、无菌牙签。 三、操作步骤 (一)单染色法 1、涂片在洁净无脂的载玻片中央滴一小滴无菌水,用无菌操作方法从菌种斜面挑取少量菌体与水滴充分混匀,涂成薄膜,涂布面积约1—1.5Cm2(图7—1A、B)。 2、干燥将涂片于室温中自然干燥 3、固定手执载片一端,使涂菌的一面向上,将载片通过微火2~3次。在火上固定,用手摸涂片反面,以不烫手为宜。不能将载片—在火上烤,否则细菌形态毁坏(图7—1C)。 4、染色将涂片置于水平位置,滴加染色液覆盖于涂菌处,染色约2rain(图7—1D 5、水洗倾去染色液。

斜置载片,用自来水的细水流由载片上端流下,不得直接冲在涂菌处,直洗至从载片上流下的水中无染色液的颜色为止(图7—1E)。 6、干燥自然晾干或用吸水纸轻轻地吸干,注意不要擦掉菌体(图7—1F)。 7、待标本完全干燥后,先用低倍镜和高倍镜观察,将典型部位移至视野中央,再用拍 图7—1负染色的推片方法 (二)口腔微生物的观察 1、单染色法 (1)在洁净无油腻的载片中央滴一小滴无菌水,用牙签取牙垢少许与水滴充分混匀,涂成薄膜。 (2)将涂片于室温中自然干燥后,按上面单染色法的步骤,进行固定、染色、水洗,干燥后镜检。 2.负染色法 (1)在洁净无油腻的载片的一端滴一小滴无菌水。

用牙签取牙垢少许与水滴充分混匀,然后加少许黑色素溶液,充分混匀。 (2)另取一载片将其边缘放在含菌载片的一端,然后推向另一端,则含菌载片上的混合液被推成薄膜。 (3)于室温中自然干燥。 (4)镜检:将光线调亮,先用低倍镜观察,再用高倍镜观察。 四、注意事项 载玻片要洁净无脂,否则菌液涂不开。涂片时,滴水不要过多,挑菌量宜少,菌膜宜薄 五、演示 1.单染色的主要步骤。; 2.负染色的推片方法。 六、实验报告 (一)绘图 1、单染色后观察到的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的形态图 2、你所观察到的口腔微生物的形态图,并注明使用的染色方法,菌体和背景的颜色 3、你所观察到的口腔微生物的形态图。

并注明使用的染色方法,菌体和背景的颜色。 (二)单染色法和负染色法操作要点。 七、问题和思考 1.涂片在染色前为什么要先进行固定?固定时应注意什么问题? 2.制备染色装片时应注意哪些事项,为什么?制片为什么要完全干燥后才能用油镜观察? 3.你知道口腔中通常存在哪些微生物吗?如何进行区分? 实验四细菌的革兰氏染色 一、实验目的和内容 目的:初步掌握细菌涂片方法及革兰氏染色法步骤 内容:1.制作细菌染色装片。 2.进行革兰氏染色法操作 二、实验材料和用具 金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大肠杆菌(E.coli)菌液,待测菌菌液1~2种。

革兰氏染色液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石炭酸复红液等)、香柏油、二甲苯、显微镜、擦镜纸、接种环、酒精灯、载玻片、吸水纸、试管、小滴管 三、操作步骤 (一)制片 1.涂菌用无菌操作方法从试管中沽取菌液一环,用接种环在洁净无脂的载玻片上做一薄而均匀、直径约lcm的菌膜。涂菌后将接种环火焰灭菌 2.干燥于空气中自然干燥。亦可把玻片置于火焰上部略加温加速干燥(温度不宜过高)。 3.固定目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上,便于染料着色,常用加热法,即将细菌涂片膜向上,通过火焰3次,以热而不烫为宜,防止菌体烧焦、变形。此制片可用于染色。 (二)染色 1.初染于制片上滴加结晶紫染液。

染lmin后,用水洗去剩余染料。 2.媒染滴加卢戈氏碘液,1min后水洗。 3.脱色滴加95%乙醇脱色,摇动玻片至紫色不再为乙醇脱退为止(根据涂片之厚度需时30s至lmin),水洗。 4.复染滴加番红(石炭酸复红)液复染1min,水洗。 5.用滤纸吸干,油镜镜检。 (三)结果 革兰氏阳性菌染成蓝紫色,革兰氏阴性菌染成淡红色。 (四)检测未知菌 用以上方法对未知菌进行革兰氏染色,并绘图、记录染色结果。 四、注意事项 1.涂片务求均匀,切忌过厚。 2.在染色过程中,不可使染液干涸。 3.脱色时间十分重要,过长,则脱色过度,会使阳性菌被染成阴性菌。 4.老龄菌因体内核酸减少。

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