常用的临床免疫学检测技术定稿

2021-04-25 13:10:37本页面

常用的临床免疫学检测技术定稿


【正文】

常用的临床免疫学检测技术 第一讲免疫浊度技术 一、免疫浊度法基本原理 免疫浊度法是可溶性抗原、抗体在液相中特异结合,产生一定大小的复合物,形成光的折射或吸收,测定这种折射或吸收后的透射光或散射光作为计算单位。 二、免疫比浊法的特点: 1、自动化免疫分析稳定性好,敏感性高(达ng/L)、精确度高(CV<5%),干扰因素少,结果判断更加客观、准确,也便于进行室内及室间质量控制。 2、自动化免疫分析快速、简便,结果回报时间短,便于及时将各种信息向临床反馈,又可节约大量人力物力,利于大批量样品的处理。 3、自动化免疫分析能更好地避免标本之间的污染及标本对人的污染。 4、自动化免疫分析可利用多道计数器、测光仪。

同一份样品同时测定几十种和临床有关的分析项目,血清用量少,具有明显的应用优势。 三、免疫浊度法分类 (一)透射光免疫浊度法 透射光免疫浊度法是个极简便的方法,测定方式是测定入射光因反射、吸收或散射后的衰减,读数以吸收光单位(A)或OD表示,这种A值反映了入射光和透射光的比率。 (二)散射比浊法 散射比浊法应用越来越多,且有替代其他免疫定量法的趋势。散射比浊的原理是根据雷利(Rayleigh)公式提出的,当复合物较小时(<3*10)呈全透射,透射与散射相当。当复合物大于入射光波的1/20时,形成不对称前向散射,在90o以前的角度测量散射光皆取得最佳效果,散射光的量代表复合物的量。

1、终点散射比浊法 2、速率散射比浊法 速率法的灵敏度与特异性都优于终点法,前者的灵敏度比后者高出3个数量级之多,但终点法稳定性好。所谓速率,是在某单位时间内形成大于3*10以上的复合物量(不是积累数),当仪器测定到某一时间单位内形成的速率下降时,即出现速率峰,该峰值的高低,即代表抗原的量。 速率散射比浊法有三大特点: 1、时间快,一般在3060s之内就可完成测试; 2、比较准确,因其测定形成速率,抗原多, 速率快; 3、节省试剂。 (三)粒子强化免疫浊度测定法 粒子强化免疫浊度测定法的基本原理是,选择一种大小适中,均匀一致的胶乳颗粒吸附或交联抗体后,当遇到相应抗原时,则发生聚集。

单个胶乳颗粒在入射光波长之内,光线可透过。当两个胶乳颗粒凝聚时,则使透射光减少,这种减少的程度与胶乳凝集成正比,当然也与抗原量成正比。 四、免疫比浊法的临床应用 (一)检测项目 1、免疫功能监测:免疫球蛋白G、A、M,免疫球蛋白轻链κ、λ,补体C3、C4测定。 2、心血管疾病监测:载脂蛋白A、B,脂蛋白(a),C反应蛋白等。 3、炎症状况监测:C反应蛋白,a酸性糖蛋白,触珠蛋白,铜蓝蛋白等。 4、风湿性疾病检测:ASO、RF、CRP 5、肾脏功能检测:尿微量白蛋白,a微球蛋白,β微球蛋白,转铁蛋白,免疫球蛋白G等。 6、营养状态监测:白蛋白,前白蛋白,转铁蛋白等。 7、凝血及出血性疾病的检测:抗凝血酶Ⅲ。

转铁蛋白,触珠蛋白等。 8、血脑屏障监测:脑脊液白蛋白,免疫球蛋白G、A、M。 (二)免疫浊度法测定中应注意的问题 1、伪浊度的影响 伪浊度形成原因很复杂,主要是抗血清含有非特异性的交叉反应性杂抗体成分;增浊剂浓度和反应时间掌握不当;样品本身的浊度处理不当;试剂的污染和变质;器材尤其是比色杯等不够清洁等因素。 2、非特异性散射光的影响 免疫浊度法经常受内源性光散射的干扰,为避免这些非特异性光散射的影响,应用透射比浊法时需保证抗体组分在3%以下,散射比浊法需保证在0.5%以下。 3、钩状效应的影响 钩状效应存在于各种免疫测定方法中,在免疫浊度测定中也十分明显。现在很多仪器已具有检查钩状效应的功能。

一经发现便可对样品稀释后复测。当病人症状与检测结果明显不符时,应怀疑其存在。 第二讲固相酶免疫测定技术 一、固相酶免疫测定的原理和类型 (一)ELISA的原理 基于抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体保持其免疫学活性,抗原或抗体的酶结合物既保留其免疫学活性,又保留酶的活性。在测定时,把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。 用洗涤的方法使固相载体上形成抗原抗体复合物与其他物质分开,最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后,底物被酶催化变为有色产物,产物的量与

故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高,故可极大地放大反应的结果,从而使测定方法达到很高的敏感度。 ELISA可用于测定抗原,也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂:1、固相的抗原或抗体;2、酶标记的抗原或抗体;3、酶反应的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具体条件,可设计出各种不同类型的检测方法。 (二)ELISA反应的类型: 1、双抗体夹心法 检测抗原最常用的方法,操作步骤如下: (1)将特异性抗体与固相载体联结,形成固相抗体。洗涤除去未结合抗体及杂质。 (2)加受检标本,与固相抗体接触反应一段时间,让标本中的抗原与固相抗体结合,形成固相抗原抗体复合物。

洗涤除去其他未结合物质。 (3)加酶标抗体。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时,固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。 (4)加底物显色。夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。 在临床检验中,此法适用于检测各种蛋白质等大分子抗原,例如乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、甲胎蛋白(AFP)、促绒毛膜性腺激素(HCG)等。双抗体夹心法只适用于二价或二价以上较大分子抗原的检出和定量分析,而不能用于半抗原等小分子的测定。 2、间接法测抗体 间接法是检测抗体最常用的方法,其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相抗原结合的受检抗体。

故称为间接法。操作步骤如下: (1)将特异性抗原与固相载体联结,形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。 (2)加稀释的受检血清。血清中的特异性抗体与固相抗原结合,形成固相抗原抗体复合物,经洗涤后,固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合,在洗涤过程中被洗去。 (3)加酶标抗免疫球蛋白(酶标抗抗体,一般为酶标抗人IgG)。它与固相复合物中的抗体相结合,从而使该抗体间接地标记上酶。清洗后,固相载体上的酶量与特异性抗体的量相关。 (4)加底物显色。颜色深度与标本中受检抗体量相关。本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。本法的主要缺点为受检标本须经稀释(1:501:20)的后才能进行测定。

否则血清中高浓度的非特异性IgG和其他干扰物质会引起阴性本底过高,影响结果的判断。 3、双抗原夹心法 反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物,以检测相应的抗体。同属抗体检测,与间接法不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。在间接法不适用时(例如包被抗原中的杂质可与酶标记的抗入IgG反应),可试用此法。此法中受检标本不需稀释,可直接用于测定,因此其敏感度相对高于间接法。在临床检验中,抗HBs的ELISA常采用本法。 4、竞争法测抗体 当相应抗原材料中含有与抗入IgG反应的物质,而且不易得到足够的纯化抗原进行包被时,可用此法检测特异性抗体.其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。

标本中抗体量愈多,结合在固相上的酶标抗体愈少。因此阳性反应呈色较浅于阴性反应。由于抗原的难得,在包被时多采用捕获法,即先包被与抗原相应的抗体,然后加入抗原,形成固相抗原。 5、竞争法测抗原 小分子抗原和半抗原因缺乏可作夹心的二个或二个以上的位点,因此不能用双抗体夹心法进行测定。竞争法的原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量愈多,结合在固相上的酶标抗原愈少。因此标本中抗原含量较多的,反应呈色较含量少的为淡。小分子激素,药物等的ELISA测定多用此法。 6、捕获法测IgM抗体 IgM抗体的检测用于传染病的早期诊断中。间接ELISA一般仅适用于检测IgG抗体。如用酶标记的抗人IgM作为二抗进行间接ELISA测定IgM抗体。

标本中同时存在的不同浓度的IgG抗体将与IgM抗体竞争,而使结合在固相抗原上的IGM抗体相应减少。另外标本中如含有类风湿因子、也会产生干扰。因此用一般的间接法测定IgM抗体不能得到准确的结果。 在捕获法中,用抗人IgM抗体包被固相,以捕获血清标本中的IgM(其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性IgM)。然后加入抗原,此抗原仅与特异性IgM相结合。继加酶标记针对抗原的特异性抗体,再与底物作用,呈色即与标本中的特异性IgM成正相关。此法常用于病毒性感染的早期诊断。 二、酶免疫测定的发展和应用 (一)ABCELISA ABC为亲和素(avidin)、生物素(biotin)、复合物(complex)的略语。

亲和素是一种糖蛋白,可以和4个生物素分子紧密结合。可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。生物素与亲和素的结合,虽非属免疫反应,但特异性强,亲和力大,二者一经结合就极为稳定。 由于一个亲和素分子有四个生物素分子的结合位置,可以连接更多的生物素化的酶分子,形成一种类似晶格的复合体。因此如把生物素亲和素系统与ELISA偶联起来,就可大大提高ELISA的灵敏度。 ABCELISA可分为酶标记亲和素生物素(labeledavidinbiotin,LAB)法和桥连亲和素生物素(bridgeavidinbiotin,BRAB)法二种。前者将酶标记在亲和素分子上;后者通过BNHS分别制成酶生物素和抗体生物素。

通过亲和素搭桥将二者结合起来。利用生物素亲和素系统对荧光免疫技术的敏感度也有明显的放大作用。ABCELISA已广泛用于细菌、病毒、寄生虫感染等的诊断中。 (二)酶联免疫电转移印斑法 Burnette于1981年建立酶联免疫电转移印斑法(enzymelinkedimmunolectrotransferblot,EITB),并称之为西部印斑(Westernblot).EITB分三个阶段进行。 第一阶段为SDS聚丙烯酞胺凝胶电泳(SDSPAGE)。抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷,在聚丙烯酞胺凝胶中从阴极向阳极泳动,分子量越小,泳动速度越快。此阶段分离效果肉眼不可见(只有在染色后才显出电泳区带). 第二阶段为电转移。

将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上。选用低电压(100V)大电流((12A),通电45分钟转移即可完成。此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。 第三阶段为酶免疫定位。将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜(相当于包被了抗原的固相载体)依次与特异抗体和酶标记第二抗体作用后,加入能形成不溶性显色物的酶反应底物,使区带染色。阳性反应的条带清晰可辨,并可根据SDSPAGE时加入的分子量标准,确定各组分的分子量。本法综合了SDSPAGE的高分辨力和ELISA法的高特异性和敏感性,是一个有效的分析手段,在蛋白质化学中应用广泛。EITB不仅用于分析抗原组分及其免疫活性,并可用于疾病的诊断。 (三)斑点ELISA 斑点ELISA(dotELISA)的特点是:1以吸附蛋白质能力很强的硝酸纤维素膜为固相载体。

公务员体检相关推荐  
三九文库 www.999doc.com
备案图标苏ICP备2020069977号