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定量PCR实验操作流程.ppt

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定量PCR实验操作流程,一:实验目的,本实验室定量PCR实验都为检测基因在mRNA水平的表达量这次示例以检测mRNA水平的表达量为例,通过染料法(SYBRGreen)进行相对定量PCR实验,分析LPS诱导巨噬细胞中IL6表达,二:背景资料,样品为LPS处理不同时间(0,1,3,6,12,24h)的巨噬细胞提取RNA。测试基因共两个:为IL6(NM031168),内参基因GAPDH(NM008084)。,三:实验内容,细胞RNA抽提RNA反转录定量PCR检测数据分析,四:实验主要仪器和试剂,主要实验仪器冷冻超速离心机常规PCR仪酶标仪电泳系统CFX96RealTimePCRSystem,四:实验主要仪器和试剂。

主要实验试剂RIzol(Invitrogen)、RNA级氯仿、冷冻异丙醇及冷冻的75%乙醇、DEPC灭菌水TaKaRaKits,五:实验操作,前期准备为避免RNase对RNA的降解及其提高实验的精确性,在实验前请准备好用DEPC处理过的离心管及其移液枪头,同时实验操作时,需戴口罩及其一次性手套。所有实验操作尽可能在冰上进行。,五:实验操作,RNA抽提样品处理贴壁细胞,去培养基后可直接加入TRIzol(510107细胞数加约为1mLTRIzol),反复吹打裂解细胞,再收集TRIzol至离心管中;(Note:如为悬浮细胞,先离心收集,加入TRIzol(510107细胞数加约为1mLTRIzol)反复吹打裂解细胞。

如为新鲜组织样品,可取50mg200mg样品直接在液氮中研磨至粉末,再转移一定量至含1mLTRIzol的离心管中,反复振荡裂解组织细胞)。,五:实验操作,RNA抽提相分离室温放置上述样品液10min左右后,每1mLTRIzol中加入氯仿为200L,盖上盖子,剧烈振荡约1min,室温静置5min,然后12000g冷冻离心15min(4),小心取出样品,通过观察可以发现样品分三层,其中最上层含有RNA样品。,五:实验操作,RNA抽提RNA沉淀小心吸取上清液约450L(每1mLTRIzol的吸取量)至含有600L冷冻异丙醇的新离心管中,混匀,12000g冷冻离心10min(4)。,五:实验操作,RNA抽提RNA洗涤去上清。

加入500L冷冻的75乙醇,弹起沉淀后12000g冷冻离心5min(4),去上清,再稍离,吸去上清液。,五:实验操作,RNA抽提RNA溶解风干约510min(注意不能风太干,只需要沉淀泛白即可),加入DEPC水约30L。贴上标签后80保存。,五:实验操作,RNA抽提RNA浓度测定吸取2L抽提的RNA用DEPC水稀释100倍后,在酶标仪上测定RNA浓度,以DEPC水做空白对照,同时记录RNA浓度及其OD260/OD280。,五:实验操作,反转录反应,五:实验操作,反转录反应普通RTPCR反应,获得cDNA产物20保存反转录产物,五:实验操作,定量PCR实验,按下列组份配制PCR反应液(反应液配制请在冰上进行)。

*1通常引物终浓度为0.4M可以得到较好结果。反应性能较差时,可以在0.21.0范围内调整引物浓度。*2建议在25l反应液中使用相当于10pg100ngTotalRNA量的cDNA为模板。反转录反应液的加入量不能超过PCR反应液总体积的10%。*3建议反应液体积为20l。(节省试剂,最低可降至15l),五:实验操作,定量PCR实验,1notreat2LPS0.1ug/ml1h3LPS0.1ug/ml3h4LPS0.1ug/ml6h5LPS0.1ug/ml12hLPS0.1ug/ml24hNegitiveControl(NC),五:实验操作,定量PCR实验将96孔板或八联管进行短暂离心,确保所有反应液在反应孔底部。

PCR反应,可以采用标准的三步法程序,也可以用二步法进行反应在PCR反应后,进行熔解曲线分析(Note:上机操作),五:实验操作,实验数据分析结果,GAPDH,IL6,五:实验操作,实验数据分析结果,

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